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DNA连接酶的作用探讨  

2013-06-03 15:31:02|  分类: 4基因工程 |  标签: |举报 |字号 订阅

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1、如何理解DNA连接酶的作用特点?

       教科书的观点:DNA连接酶无特异性,其催化DNA片段末端连接的情况分两种:(1)催化相同或互补的黏性末端连接;(2)催化同一种限制酶切割产生的平末端连接。两种情况下,末端的“拼接”都会形成“回文序列”。

       然而,在基因工程的实际操作中,催化DNA片段末端连接的方法是非常灵活的。例如,当目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用时,而用不同的限制性内切酶切割后的黏性末端不能互补结合,则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端,再用T4DNA连接酶连接,但平末端连接要比黏性末端连接的效率低得多。 由此可见,DNA连接酶可以催化两种不同限制酶切割产生的平末端连接,而两个平末端拼接后,并不是“回文序列”。 

       结论:DNA连接酶催化两个末端连接形成的新序列并不都是“回文序列”。(注:回文序列——双链DNA分子中一段旋转对称的核苷酸序列,即以对称轴为轴心旋转180°后呈对称状态,它是大多数限制性内切酶的识别位点。《中国百科大辞典》)

 2、如何理解“双酶切”策略下基因表达载体的构建和筛选?

      在构建基因表达载体时,最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性酶进行酶切,产生两个不同的黏性末端。再用这两种限制酶对合适的载体进行酶切,也产生两个不同的粘性末端。酶切后的目的基因和载体,由于它们各自的两个末端不同,都不会发生自身环化。然后在DNA连接酶的催化下,目的基因片段只能从一个方向插入载体中(同一种限制酶切割产生的相同黏性末端才可以连接),重组的效率较高,也易于筛选出重组子。

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