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动物胚胎工程6:胚胎干细胞  

2013-04-10 20:29:14|  分类: 现代科技专题 |  标签: |举报 |字号 订阅

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干细胞(Stem cell)具有自我复制的能力,在一定条件下能分化成各种功能细胞。

1.根据干细胞所处的发育阶段:胚胎干细胞(embryonic stem cellESCs)成体干细胞(somatic stem cell,SSCs)2.根据干细胞的发育潜能:全能干细胞(totipotent stem cell,TSC)多能干细胞(pluripotent stem cell)单能干细胞(unipotent stem cell)。胚胎干细胞的发育等级较高,是全能干细胞,而成体干细胞的发育等级较低,是多能或单能干细胞。

个体发生过程:

动物胚胎工程6:胚胎干细胞 - 生物清风岭 - 生物清风岭

胚胎干细胞(Embryonic Stem cell, ES细胞):当受精卵分裂发育成囊胚时,内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。进一步说,胚胎干细胞(ES细胞)是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性,能分化出成体动物的所有组织和器官,包括生殖细胞。

成体干细胞:成年动物的许多组织和器官,比如表皮和造血系统,具有修和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下,成体干细胞或者产生新的干细胞,或者按一定的程序分化,形成新的功能细胞,从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。

造血干细胞:造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源,它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。在20世纪五十年代,临床上就开始应用骨髓移植(BMT)方法来治疗血液系统疾病。

神经干细胞:神经干细胞的研究仍处于初级阶段。论上讲,任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经干细胞功能的紊乱。

干细胞的作用:动物体内干细胞的正常作用是在发育的过程中可提供不同的细胞型,以生长成不同的组织和器官。它们也提供替代细胞以修复身体不同部分的损伤。干细胞疗法就是利用已特殊分化的干细胞,通过特殊的途径提供细胞去替代那些在退行性过程和损伤中失去的细胞。

干细胞的主要来源:目前人干细胞的主要来源或者潜在来源如下:①胚泡,可以提供多能干细胞;②胎儿组织,可以提供多能或者专能干细胞;③脐带血,可以提供专能干细胞;④成人组织,可提供专能干细胞或单能干细胞。

胚胎干细胞 (embryonic stem cells,ESC)是一种从早期胚胎内细胞团原始生殖细胞经分离、体外培养、克隆等得到的具有发育全能性的细胞。两个主要特性:无限增殖、发育全能性。

胚胎干细胞的生物学特性

ES细胞具有胚胎细胞的特性,在形态上表现为体积小、核大,核仁突出,培养时呈克隆状生长;在功能上,ES细胞具有发育的全能性,是指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力,即ES细胞发育成完整动物体的能力ES细胞具有细胞系的特征,在饲养层上能维持未分化状态并实现自我更新。因为可无限增殖,也可冷冻保存。

ES细胞的应用前景

1.发育和细胞分化研究:ES细胞的多能性可以在一定培养条件下转化为特定的细胞。

2.基因功能研究

3.药物筛选和细胞移植治疗:1.新药的发现、筛选及安全性实验:如药物机理及毒性实验。2.的临床价值,可作为组织移植、细胞治疗和基因。疗的细胞来源:制造细胞、组织和器官;人ES定向诱导分化为人体器官;生产用于人类器官移植的动物器官:无免疫排斥;猪可以作为人异种器官移植的器官供体来源。

治疗性克隆:把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚,把重组胚体外培养到囊胚,然后从囊胚内分离出ES细胞,获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞、肌肉细胞和血细胞),用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗,而非得到克隆个体,科学家们称之为“治疗克隆”。流程:去核卵细胞+体细胞核克隆囊胚分离内细胞群—ES细胞

干细胞技术治疗疾病必须经历的三阶段:1.将组织的成体干细胞直接移植给相应组织坏损的病人,以。期达到治疗目的。2.在体外对干细胞进行诱导,使之定向分化成所需细胞,或对干细胞进行基因修饰。然后对分化的细胞或修饰的干细胞进行筛选,把合格的细胞移植给病人。3.进行体外“器官克隆”,获得一个有空间结构和正常生理功能的人体器官

4.生产克隆动物(生殖性克隆):由于ES细胞是具有全能性、未分化的细胞,因此是制作克隆动物很好的核供体ES细胞具有可以无限地传代增殖,而且不改变其基因型和表现型的特点。如果以ES细胞作为核供体进行核移植,可以在短时间内获得大量基因型和表现型完全相同的个体。而且用ES细胞与胚胎进行嵌合克隆动物,可以解决哺乳动物远缘杂交的困难,生产出珍贵的动物,也可以进行异种动物克隆,有助于保护珍惜野生动物。

5.生产转基因动物:建立转基因细胞系,抗病育种;药用蛋白。ES细胞可作为基因打靶的靶细胞,经打靶引入定点整合外源基因,提高转基因动物的整合率和表达效果。ES细胞也可进行基因敲除,获得基因敲除动物,如猪可以作为人异种器官移植的器官供体来源。而利用ES细胞作为基因载体,得到基因整合细胞,将载体ES细胞直接进行核移植或者通过与胚胎嵌合获得嵌合动物,ES细胞在嵌合体中分化发育成全能性的生殖细胞,即可以得到携有目的基因的转基因动物。

ES细胞系的建立过程

分离囊胚的内细胞群

与成纤维细胞共培养,ES细胞非分化增殖

分离胚胎生殖腺脊细胞

--胚胎干细胞的鉴定--定向诱导分化--成体干细胞--功能细胞

ES 细胞分离培养的基本程序

1.选择抑制ES细胞分化的培养体系2.早期胚胎的选择3.ES细胞的分离4.ES细胞的保持5.ES细胞的鉴定6.ES细胞的分化潜力验证

1、培养体系的选择:饲养层培养体系:用作饲养层的细胞多数是具有贴附能力的细胞(如成纤维细胞)。接种 ES 细胞之前必须对饲养层细胞进行有丝分裂阻断,使其保持活力但不会增殖。饲养层细胞:指丝裂霉素C处理或伽马射线照射后阻断有丝分裂后制成的细胞单层,促进增殖,抑制分化,是一种常规稳定ES细胞的培养方式。无饲养层培养体系:必须加入白血病抑制因子。2ICM细胞的分离方法:机械剥离法;免疫方法去处滋养层细胞;酶消化后培养3ES细胞的鉴定:1)细胞形态与结构ES细胞形态表现为胞体小、泡状、核大 (核质比高)、细胞聚集成集落生长(鸟巢状)、细胞排列紧密、无细胞界限、能连续稳定传代且不分化。(2)细胞功能(3)细胞表面的特殊标志:AKP阳性(4)细胞内特异基因的表达:Oct-4;NanogES细胞检测指标:(1)细胞内碱性磷酸酶活性高(2)端粒酶活性高(3)细胞膜表面有特殊的标记:SSEA-3, SSEA-4,TRA-1-60, TRA-1-81(4)能分化成三个胚层的细胞,将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(5)可体外诱导分化为各种成体干细胞

干细胞诱导分化的常用方法:1)加入诱导细胞分化的因子或化学物质,如VGEFbFGF DMSORA等(2)将ES细胞与特定的细胞共培养(3)将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内

ES细胞研究存在的问题

(一)分离培养系统问题:目前ES细胞的分离培养体系仍沿袭传统的方法,分离成功率很低,真正建系的ES细胞只有小鼠、人和恒河猴。(二)分化与临床应用的问题:通过对ES细胞的诱导分化,不仅可以研究细胞分化的分子机理,同时对组织损伤修复有重要作用。然而,目前还无法对ES细胞实施专一性的诱导分化,无法在体外分化发育成一完整的器官,而且可用于诱导分化的化学物质种类有限。即使ES细胞诱导分化后用于异体移植,不仅在免疫排斥现象,而且还可能导致畸胎瘤。因此,ES细胞分化的分子调控机制,以及如何对移植的细胞进行监控和评估等一系列问题还有待于进一步研究。(三)新来源的ES细胞问题:发展迅速的治疗性克隆、iPS细胞等技术,在利用病人正常细胞进行组织自我修复方面具有巨大的应用前景,不仅可以降低或消除传统ES细胞治疗所面临的免疫排斥问题,而且可以避免过多的伦理道德问题。然而,这些方法都涉及尚不十分清楚的体细胞核重编程的问题,诱导效率仍然较低,因此,这些新型的干细胞真正应用于临床还有很多问题尚待解决,尤其需要深入研究iPS细胞产生机理。(四)伦理道德问题:ES细胞的研究和应用一直牵涉到许多法律、宗教和伦理学问题,除寻找可以产生多能性细胞的其它途径以外,还需要加强ES细胞研究的相关规范和监控。

人体胚胎干(hES)细胞

优点:有潜力在体内发育成任何细胞类型。缺点:1)供体卵母细胞的来源困难,ES细胞建系效率低(2)免疫排斥反应(3ES细胞具有成瘤性(4)体外保持ES细胞全能性的条件非常复杂(5)伦理学争论

诱导多能干细胞:通过基因转染技术(gene transfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞使体细胞直接重构成为胚胎干细胞细胞样的多潜能细胞。称之为诱导多能干细胞即 iPS细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC特点:1.表达细胞表面特异性标志 SSEA-12.AP碱性磷酸酶染色阳性3.端粒酶活性高4.畸胎瘤产生5.体外分化为拟胚体6.具有分化为各种细胞的潜能7.形成嵌合体的能力

iPS细胞的基因调节:iPS 细胞是利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2, Klf4 c-Myc)的组合转入分化的体细胞中,使其重编程为类似胚胎干细胞的一种细胞类型。

1Sox2是胚胎干细胞特异性转录因子,其与Oct-4一样均为体细胞重编程所必须的基因,除了可与Oct4协同调节维持细胞的多能性之外,还能促进干细胞向神经外胚层分化。

2Oct4Oct4POU家族的转录因子,维持细胞的多能性,是体细胞诱导为iPS细胞所必须的基因。在小鼠和人的ES细胞中,Oct4表达的抑制将会导致自发性分化为滋养层细胞,Niwa等实验结果表明,Oct-4能够维持ES细胞未分化状态并促进其增殖,并认为Oct-4的活化是重编程为多能干细胞的标志。

3c-Mycc-Myc基因是继p53基因之后最受关注的原癌基因之一, c - M y c 属于H L H 蛋白家族,还有一个n-Myc成员。c-MycN端可以与TRRAPTIP48相作用,影响组蛋白乙酰化酶、ATP酶的作用,而C端含有螺旋(HLH)及亮氨酸拉链结构域,在与Max蛋白形成稳定的复合物后与DNA序列(CACA/GTG )相结合,调节基因的表达。

4Klf4Klf4属于Kruppe-like factors(Klfs)家族的一员,在小鼠ES与有丝分裂后期的皮肤和胃肠上皮细胞中高表达。Klf4的过表达导致Oct4表达的维持和ESCs分化的抑制。Klf4也可以通过抑制p53的表达而间接上调Nanog的表达,通过抑制p53,阻止由c-Myc引起的细胞凋亡。

iPS细胞的建系技术:首先,将几个重要的多能性相关基因通过诱导载体导入小鼠或人类的成纤维细胞中;其次,基因导入一段时间后,通过药物或形态学特征对转染的细胞进行选择;最后,筛选出的细胞要经过一系列严格的检验,并与ES 细胞进行比较,从而才能证明其多能性。

1iPS细胞的来源:1.不同细胞来源:包括成体小鼠肝脏细胞、胃粘膜细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠尾尖成纤维细胞、淋巴细胞;人皮肤成纤维细胞、人角蛋白细胞、人羊水细胞、人外周血细胞、人T淋巴细胞等。2.不同物种来源:包括猪成纤维细胞;罗猴成纤维细胞;羊成纤维细胞等。1)几个重要的基因:细胞的多能性受到许多因子精密而又复杂的调控。ES 细胞和体细胞融合后能诱导体细胞核的重编程,这一现象提示在ES 细胞中存在着一些因子,这些因子对于多能性的建立可能至关重要。Oct4 Sox2c-myc Klf44个基因中的任意2个或3个组合,都无法形成具有ES细胞特性的iPS细胞,说明这个基因缺一不可。2)几种诱导载体:1.逆转录病毒载体和慢病毒载体。其具有整合效率高、诱导效率高的特点,缺点是基因插入造成可能的基因突变,具有一定的致瘤性。2. 质粒载体。可以瞬时表达,可以避免基因插入突变,但诱导时间长,诱导效率低。3.Cre/Loxp 系统,piggyBac转座系统。可有效去除外源基因,但诱导效率低。3)小分子化合物诱导与siRNA诱导:最初iPS细胞诱导效率只有0.01%左右,使用小分子化合物可以显著提高iPS细胞诱导效率。如VPA(2-丙基戊酸)5-AZA(5-氮杂胞苷)BIX01294(G9a组蛋白甲基化转移酶抑制剂)BayK8644(钙通道激动剂)、维生素C等可促进细胞重编程,显著提高iPS细胞诱导效率。在四因子诱导的基础上加入对RNA翻译水平起特定调控的siRNA,也可提高iPS诱导效率,如p53基因的siRNAUtf基因的cDNA等。4)蛋白质分子诱导:为避免病毒和外源基因对iPS细胞的影响,研究者直接采用4个转录因子蛋白对受体细胞直接诱导。采用隔天多次将受体细胞与外源蛋白进行共培养,通过特定信号转导肽将其运送至受体细胞核内发挥作用,通过4轮蛋白因子处理,再结合VPA的辅助,产生iPS克隆。该方法的缺点是:诱导效率极低,所需时间很长。

iPS 细胞的筛选:在诱导的过程中,监测细胞的变化并利用直观的方法挑选出可能具有了多能性的细胞对整个工作至关重要。用形态学的标准来代替报告基因的筛选是十分有价值的,Maherali 等人发现,仅依靠形态学筛选可能就足以建立iPS细胞系。

获得细胞的鉴定:细胞的多能性要满足两个基本条件强大的自我更新能力和分化潜能。目前有很多种具体的指标可用来评判获得的iPS 细胞是否像真正的ES 细胞一样具有多能性,如形态学标准、标志分子的表达、生长特性、发育潜能、表观遗传学特征等。iPS 细胞与MEFs 融合之后,能够赋予MEFs 类似于ES 细胞的表型,这是对iPS 细胞多能性的另一个严格检验。

iPS细胞的应用前景: (一)生产转基因动物(二)用于疾病的治疗

iPS细胞研究存在的主要问题: 1.提高iPS细胞重编程效率:提高iPS细胞重编程效率主要有两个方面:一是尽量减少诱导所需的转录因子;二是添加化学小分子,通过影响表观遗传修饰,提高重编程效率。小分子RNA作为一种易于合成、高效特异、副作用小的物质,在疾病iPS 细胞领域受到了广泛的关注。有研究证明胚胎干细胞特异的小分子RNA可以提高iPS细胞诱导效率。2.去除病毒在iPS细胞重编程中可能带来的影响iPS细胞诱导过程中,由病毒转导引入的外源基因,尤其是c-MycKlf4在整合入基因组后可能会造成肿瘤发生或基因突变。因而,尽量避免病毒或病毒整合的介入是疾病iPS研究中的一个重要方向。3.iPS细胞治疗中面临的免疫排斥和致癌问题

iPS细胞的研究价值与意义: 1.iPS细胞与ESC相比之优势:成功避开伦理之争

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